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文库筛选技术的发展及在肿瘤研究中的应用(2)
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摘要：3 CRISPR/Cas9 高通量文库的筛选原理及其在肿瘤相关研究中的应用 3.1 CRISPR/Cas9文库筛选原理 用于高通量筛选文库的形式主要有阵列文库和混合文库两种。前
3 CRISPR/Cas9 高通量文库的筛选原理及其在肿瘤相关研究中的应用
3.1 CRISPR/Cas9文库筛选原理
用于高通量筛选文库的形式主要有阵列文库和混合文库两种。前者将单个或数个sgRNA列于芯片或多孔板中进行处理，每孔中的基因编辑序列已知；后者则是用计算机设计待筛选sgRNA文库并富集阳性克隆，随后转至宿主细胞以引入各种基因突变[1]，最终通过高通量测序等方法获得结果。相比之下，混合文库筛选成本低、操作简单且可用于体内研究，能够更全面地覆盖全基因组，侵染的细胞可在长期培养后检测结果[21]，因而CRISPR 文库多使用混合文库形式进行高通量筛选。其操作流程主要包括设计合成sgRNA文库、Cas9细胞系的构建、表型选择、高通量测序、生物信息学分析、候选基因和脱靶效应的验证等（图1）。
3.1.1 sgRNA文库的设计与合成 对于高通量筛选，文库的大小是影响筛选结果的关键因素之一。全基因组文库通常包含超过10万个sgRNA，一方面可以识别更多感兴趣的基因，但另一方面也会耗费大量时间和金钱。而在由激酶或膜蛋白等构成的特定基因组文库中进行筛选更易实现每个sgRNA的高覆盖率，提高数据质量，因而将会是高通量筛选更好的选择。目前市面上已有各类sgRNA在线设计软件，如CRISPR-FOCUS、CHOPCHOP、CRISPR library designer（CLD）等，可根据需求选择合适的软件设计sgRNA文库，但需保证其较低的脱靶效率。
3.1.2 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞 CRISPR/Cas9高通量文库筛选方法中，最关键的步骤是构建慢病毒载体。将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现针对不同sgRNA相对应基因的功能筛选。根据Cas9和sgRNA是否构建在同一慢病毒载体上可大致分为单载体系统和双载体系统。有研究者使用具有不同抗生素选择标记的单独病毒载体递送 Cas9（lentiCas9-Blast）和 sgRNA（lentiGuide-Puro），使得LentiGuide-Puro的功能性病毒滴度与原始lentiCRISPRv1相比增加了约100倍[5]。但也有研究者认为在sgRNA文库构建之前预先产生表达Cas9的细胞系，即双载体系统对于文库筛选是有利的。尽管双载体系统需要更长的制备时间，但他们发现单载体系统内Cas9核酸酶的表达可能会影响染色体上特定sgRNA序列介导的突变效率[22]。
图1 CRISPR/Cas9高通量筛选流程Fig.1 CRISPR/Cas9 high-throughput screening flow chart.
3.1.3 阳性或阴性筛选 筛选工作的另一项重要步骤是选择恰当的筛选策略。根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选指施加一定的筛选压力，经文库扰动后野生型细胞致死，仅有获得抗性的细胞存活。与阳性筛选不同，阴性筛选是通过比较不同筛选时间点的sgRNA丰度差，获得缺失的sgRNA，分析其所对应的基因，从而找出可能影响细胞生长的候选基因。
3.1.4 高通量测序与生信分析 此外，利用生物信息学方法寻找候选基因，排除假阳性或假阴性筛选结果，对CRISPR高通量筛选研究结果的后期分析至关重要。从所选的细胞亚群中提取基因组DNA，DNA模板应足量以保证文库的丰度。在提取基因组DNA 后对sgRNA的靶向区域进行PCR扩增，随后对这些区域进行高通量测序以量化它们的相对丰度[22-23]。根据筛选前后的sgRNA相对丰度变化确定sgRNA是被富集还是消耗，从而确定基因型与表型之间的关系。利用生物信息学工具可通过评估同一基因中多个sgRNA的富集水平来确定某一基因是否在相同背景下显著富集。
3.1.5 验证候选基因 用CRISPR/Cas9 技术筛选出若干个候选基因后，需要通过一系列方法进行验证，从而鉴定出调控特定表型的功能基因。首先需分析其脱靶情况，若非靶标位点在外显子内可能导致假阳性结果。候选基因的进一步验证非常必要，使用CRISPR/Cas9技术进行单个基因敲除，通过筛选单克隆细胞构建候选基因敲除细胞系，在基因分型和免疫染色确认基因已被敲除后，检测候选基因敲除对病毒复制的影响，同时可通过遗传互补试验确定其作用是否由基因敲除所致[24-25]。
3.2 CRISPR/Cas9高通量文库筛选技术在肿瘤相关研究中的应用
CRISPR/Cas9技术为科学家提供了一个强大的基因组改造工具，通过构建高通量文库筛选平台，可研究肿瘤发生发展的相关基因，筛选和研发肿瘤治疗药物，也可进行肿瘤免疫治疗等。
3.2.1 运用CRISPR/Cas9高通量文库筛选肿瘤发生发展的相关基因 CRISPR/Cas9技术可通过构建sgRNA文库筛选维持肿瘤细胞生长发育的相关基因，从而针对这些靶基因进行肿瘤机制研究和治疗。Korkmaz等利用CRISPR/Cas9敲除技术分别在人BJ细胞和乳腺癌细胞中构建筛选文库，发现p53效应基因CDKN1A的结合增强子是永生化人体细胞中致癌基因诱导的衰老（OIS）所必需的元件，Erα效应基因CCND1的结合增强子是乳腺癌细胞生长发育的重要元件[26]。为发现TP53野生型尤文肉瘤的特异靶点，有研究者使用CRISPR/Cas9 GeCKO文库在尤文肉瘤细胞系中筛选出MDM2、MDM4、USP7和PPM1D 4种调节因子，并使用遗传和药理学方法验证这些靶标通过p53作用机制在尤文肉瘤中的依赖性[27]。Chen等[28]利用全基因组文库筛选揭示了EZH2在MYCN癌症基因扩增的神经母细胞瘤中的依赖性。
文章来源：《知识文库》 网址: http://www.zswkbjb.cn/qikandaodu/2021/0316/779.html
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