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文库筛选技术的发展及在肿瘤研究中的应用(3)

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摘要：

由于肝肿瘤的遗传异质性，如何识别肝肿瘤抑制因子或抑癌基因一直是个难题。麻省理工研究人员[29]用含有67 000 个sgRNA 的mGeCKOa 文库感染过表达MYC的p53缺失小鼠胚胎肝祖细胞，将转导的细胞皮下移植到裸鼠体内，筛选出Plxnb1、Flrt2和B9d1等肝肿瘤抑制因子，并通过MAPK验证了RAS信号。Zhu等[30]通过构建配对指导 RNA（paired-guide RNA,pgRNA）CRISPR 文库对人肝癌细胞中的长非编码RNA 进行高通量筛选。他们建立了靶向671 个lncRNA、含12 472对gRNA的文库，通过筛选确定了51个可正向或负向调节癌细胞生长的长非编码RNA，并对其中9种进行了生物功能的验证。重庆医科大学实验室通过在SK-Hep1肝癌细胞系中建立AT富集作用域2（ARID2）基因敲除模型，发现ARID2通过靶向p-Rb-E2F信号通路抑制cyclinD1和cyclinE1的表达进而抑制肝癌细胞增殖，证实ARID2作为抑癌基因参与肝癌的发生和进程[31]。另有研究人员筛选出NF1、TSC2、NF2、BIM 和Plnb1 这5个与肝癌生长密切相关的基因[32]。

3.2.2 CRISPR/Cas9文库技术在肿瘤药物研发中的应用 CRISPR/Cas9文库技术也为癌症药物学研究提供了有力工具，可利用CRISPR系统建立精确的肿瘤细胞模型，揭示细胞机制并确定新的药物靶点，从而开发更高效且安全的肿瘤药物。如亓磊研究组借助CRISPR/Cas9基因敲除技术筛选上千个基因突变组合，寻找可以选择性杀死癌细胞的突变，从而找到癌症的弱点[33]。研究人员针对3种实验室细胞系（人宫颈癌细胞，肺癌细胞和胚胎肾细胞）中的73个基因，总共150 000种基因组合研发了这一新系统，结果证明，这种方法能揭示超过120种新的合成致死相互作用，给未来癌症药物的研究提供了一个新的方向。

Ryan等[34]在胶质母细胞瘤（GBM）中开发出一种腺相关病毒（AAV）介导的CRISPR自体筛选。他们首先构建了一个包含288 个sgRNA 的小鼠肿瘤抑制因子（mTSG）文库，并通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子构建可编码Cre重组酶的AAVCRISPR载体，然后将经载体包装后的sgRNA 注射到条件Rosa26-LSLCas9-GFP小鼠中，去观察星形胶质细胞中Cas9和GFP的条件表达。结果发现，Zc3h13或Pten的突变改变了Rb1突变体的基因表达谱，使得它们对替莫唑胺更具抗性，这给胶质瘤抑制剂体内研究提供了一个良好前景。Matthew等[35]在RB1-/-小细胞肺癌（SCLC）细胞系中构建了包括9100个靶向1350个基因的sgRNA文库进行筛选，发现RB1-/-SCLC细胞系过度依赖与染色体分离相关的多种蛋白，如Aurora B激酶。在此基础上，他们发现在SCLC和其他RB1-/-癌症中，pRB缺失是提高Aurora B激酶抑制剂敏感性的预测标志物，为降低多种癌症的耐药性提供借鉴意义。荷兰研究团队使用CRISPR/Cas9 GeCKO 文库在BRAFV600E黑色素瘤细胞系中证明癌症药物成瘾由ERK2 依赖的表型转换中继[36]。

在癌症化疗中，BAX可能是某些细胞毒性药物作用的主要驱动因子[37]。有研究者使用87 897个sgRNA，靶向个小鼠基因的文库感染稳定表达Cas9 的mcl1（myeloid cell leukemia-1）缺陷小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），证实了VDAC2与BAX相互作用促进BAX介导细胞凋亡[38]。VDAC2的突变或沉默可能是慢性淋巴细胞白血病药物——维奈托克耐药的潜在驱动因素。另外，为了寻找急性髓系白血病(AML)治疗的新靶点，研究人员使用全基因组的CRISPR/Cas9文库进行体内外筛查，确定了DCPS作为AML治疗的靶标基因，并阐明了pre-mRNA代谢途径。RG3039是一种最初用于治疗脊髓性肌萎缩症的DCPS抑制剂，通过诱导premRNA错接表现出抗白血病活性，因而下一步我们可以拓展其在AML治疗中的应用[39]。

3.2.3 CRISPR/Cas9文库技术在肿瘤免疫治疗中的应用近年来肿瘤免疫治疗因其显著疗效和创新性备受关注，而CRISPR/Cas9技术在肿瘤免疫治疗研究中也显示出广泛的应用前景。程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）表达的变化会影响T细胞活化并帮助肿瘤细胞发生免疫逃逸，导致T细胞治疗效果不理想。为解决PD-1检查点阻滞免疫疗法仅对少数肿瘤患者有效的问题，Manguso等[40]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在免疫治疗小鼠体内进行筛选，测试了黑色素瘤细胞表达的2368个基因，以识别与检查点阻滞协同或引起耐药性的基因。最终发现干扰素-γ信号通路中的缺陷导致了对免疫疗法的抗性。Marian 等[41]使用全基因组CRISPR/Cas9筛选发现CMTM6蛋白是广泛癌细胞中PD-L1的关键调节因子，为PD-L1调节的生物学提供了新的见解，确定了这一免疫检查点中以前未被认识的主要调节因子，并突出了克服肿瘤细胞免疫逃避的新潜在治疗靶点。

体细胞基因突变可以改变癌细胞对基于T细胞的免疫疗法的脆弱性。美国研究人员使用包含123 000个sgRNA的CRISPR/Cas9文库筛选分析在肿瘤细胞中丧失损害CD8+T细胞效应器功能（EFT）的基因[42]。他们将来自癌症基因组图谱的11 000个患者肿瘤中的EFT基因与细胞溶解活性相关联，然后在免疫治疗效果不显著的患者肿瘤中鉴定了APLNR 的多种功能丧失突变。结果显示APLNR与JAK1相互作用，调节肿瘤中的干扰素-γ反应，其功能丧失降低了小鼠模型中过继细胞转移和检查点阻断免疫疗法的功效。总的来说，他们将EFT必需基因的丧失与癌症对免疫疗法的抗性或无应答性联系起来。除此之外，有研究团队使用基因组规模的CRISPR/Cas9筛选来鉴定肿瘤细胞对抗细胞毒性T细胞杀伤的机制[43]他们证明了PBAF复合物可降低肿瘤细胞内干扰素-γ诱导基因的染色质可及性，从而增加对T细胞介导的细胞毒性的抗性，为临床免疫治疗提供机制性理解。